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技术文章

ELISA法检测肿瘤坏死因子


点击次数:759 发布时间:2013-04-22

           肿瘤坏死因子(TNF)是由激活的单核细胞巨噬细胞受内毒素刺激后产生的一种分子量为17 000的蛋白质。其中,由巨噬细胞产生的称TNF-α,是巨噬细胞介导细胞毒效应的细胞因子;由淋巴细胞产生的称TNF-β。TNF在体内具有广泛的生物学活性:可作为免疫应答中的一种中间介质,ELISA试剂盒既有抗病效应,又有致病效应;可引起肿瘤的出血坏死;可刺激成纤维细胞增殖;可增加HLA-A、HLA-B、HLA-C抗原的表达;可激活中性粒细胞及杀伤细胞;可促进B细胞增殖及分化、增加IL-2受体表达。肝脏是TNF的主要发源地,同时也是TNF清除的主要部位。目前,以TNF-α在临床的意义较大,是内毒素引起肝损害的重要介质。TNF-α只有通过与靶细胞表面的膜型受体(mTNF-aR)特异结合才能发挥毒性效应,这一结合过程又
受血清中可溶性TNF-α受体(sTNF-aR)的调节和制约,而sTNF-aR可与mTNF-aR竞争结合TNF-。。临床上常以检测TNF-α为主。
[检测方法] ELISA法
[方法学原理] 在微孔反应板上包被抗人TNF-α单克隆抗体,细胞因子ELISA试剂盒待测标本和标准品中的TNF-a会与单克隆抗体结合,游离的成分被洗去,同时加入生物素化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异结合,抗人TNF抗体与结合在单克隆抗体上的人TNF-α结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。加入显色剂,若反应孔中有TNF-α,HRP会使无色的显色剂呈现蓝色,加终止液变黄色。在波长450nm处测吸光度,TNF浓度与吸光度成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中的TNF-α浓度。
[标本准备] 静脉血2ml,不抗凝。
[试剂]
1.预包被微孔反应板
2.浓缩酶结合物
3.酶结合物稀释液
4.标准品和标本稀释液
5.浓缩生物素化抗体
6.IFN标准晶
7.浓缩洗涤液
8.显色剂A、B
9.终止液
[仪器] 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。
[检测步骤]
1.在微孔反应板相应孔中分别加入待测样本、不同浓度标准品100txl,再加生物素化抗体工作液50tzl。
2.振荡混匀,置20-25℃环境中温育120min。
3.将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,干燥。
4.除空白孔外,加入酶结合物工作液100u1。
5.振荡混匀,置20-25℃环境中温育30min。
6.将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,干燥。
7.每孔加入显色剂A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37C环境中避光显色10min。
8.加入终止液50ul后,轻轻振荡混匀。用酶标仪(450nm波长)测定各孔吸光度,与标准曲线对照,求出TNF值。
[正常参考值] 各实验室可根据检测方法的不同确立正常参考值。
[注意事项]
1.试剂盒从冷藏环境中取出时应在室温环境中平衡30min后方可使用,未用完的微孔条用自封袋密封保存。
2。酶标板洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止孔内有游离酶不能洗净。应设定30~60s的洗涤浸泡时间。
3.滴加试剂前应将滴瓶翻转数次,使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直,以使滴量准确。
4.所有样品和废弃物都应按传染源处理。终止液为2mol/L硫酸,使用时应注意安全。
5.每批样本应同时做标准曲线。
6.若标本OD值在标准曲线测定范围以外,应适当稀释后重测。
[临床意义] 类风湿关节炎、多发性硬化、恶性肿瘤、器官移植患者血清TNF升高。

 
 
 
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