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技术文章

犬γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒说明书


点击次数:542 发布时间:2013-10-26
本试剂盒仅供研究使用
 
检测范围:0.78 ng/ml - 50 ng/ml
zui低检测限:0.195 ng/ml
特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的犬IFN-γ,且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期:6个月
预期应用:ELISA法定量测定犬血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中IFN-γ含量。
 
说明:
1.        试剂盒保存:-20(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。
2.        浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
3.        中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
4.        刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
 
概述:
干扰素(IFN)是1957年被发现的。它是一类分泌性蛋白,具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异,可分为α-1b型干扰素、β-干扰素和γ干扰素。γ干扰素(IFN-γ)也叫IFN,主要由活化T细胞产生,活化NK细胞也可产生IFN-γ。人IFN-γ基因定位于12号染色体,在DNA水平上IFN-γ基因与IFN-α/β基因无同源性。人IFN-γ成熟分子由143个氨基酸组成,糖蛋白,以同源双体形式存在,分子量为40kDaIFN-γ的生物学作用有较严格的种属特异性,人IFN-γ只作用于人或灵长类动物的细胞。其生物学作用有:(1)诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、星状细胞等MHCⅡ类抗原的表达,使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程。此外,IFN-γ可上调内皮细胞ICAM-1(CD54)表达,促进巨噬细胞FcγR表达,协同诱导TNF并促进巨噬细胞杀伤病原微生物。(2)促进LPS体外刺激小鼠B细胞分泌IgG2a,降低IgG1IgG2bIgG3IgE的产生;抑制由IL-4诱导的小鼠B细胞增殖,IgG1IgE产生以及FcεRⅡ表达;促进SAC诱导的人B细胞的增殖。(3)协同IL-2诱导LAK活性,促进T细胞IL-2R表达。(4)诱导急性期蛋白合成,诱导髓样细胞分化。
 
实验原理:
用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗IFN-γ抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗IFN-γ抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
 
试剂盒组成及试剂配制:
1.        酶联板(Assay plate ):一块(96孔)。
2.        标准品Standard):2冻干品
3.        样品稀释液(Sample Diluent1×20ml/瓶。
4.        生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent1×10ml/瓶。
5.        辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 HRP-avidin Diluent1×10ml/瓶。
6.        生物素标记抗体(Biotin-antibody1×120μl/瓶(1100
7.        辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin1×120μl/瓶(1100
8.        底物溶液(TMB Substrate1×10ml/瓶。
9.        浓洗涤液(Wash Buffer1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.    终止液(Stop Solution1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
 
需要而未提供的试剂和器材:
1.        标准规格酶标仪
2.        高速离心机
3.        电热恒温培养箱
4.        干净的试管和Eppendof
5.        系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,用多通道移液器
6.        蒸馏水,容量瓶等
 
标本的采集及保存:
1.        血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃-80℃保存,但应避免反复冻融。
2.        血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃-80℃保存,但应避免反复冻融。
3.        细胞培养物上清或其它生物标本:1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃-80℃保存,但应避免反复冻融。
注:标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
 
标本的稀释原则:
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。zui后计算浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”
 
标准品的稀释原则:
2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为50 ng/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释50 ng/ml25 ng/ml12.5 ng/ml6.25 ng/ml3.12 ng/ml1.56 ng/ml0.78 ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml,临用前15分钟内配制。
如配制25 ng/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml50 ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
 
生物素标记抗体的稀释原则:
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
 
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
 
操作步骤:
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.        加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2.        弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
3.        温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
4.        每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl37℃60分钟。
5.        温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
6.        依序每孔加底物溶液90μl37℃避光显色30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7.        依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.        用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
 
1.        用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
2.      每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3.        为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。
4.        未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5.        建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
 
洗板方法:
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
 
计算:
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
 
注意事项:
1.        当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。
2.        洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
3.        一次加样时间控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.        请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。
5.        如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请zui后乘以稀释倍数。
6.        在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
7.        底物请避光保存。
8.        不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
 
 
 
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