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技术文章

人Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)elisa试剂盒说明书


点击次数:593 发布时间:2013-11-11

本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中Col Ⅲ含量。

实验原理
用纯化的Col Ⅲ抗体包被微孔板,制成固相载体,往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的Col Ⅲ抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的Col Ⅲ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度( 值),计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制
1、 酶标板:一块(96孔)
2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为400 ng/ml,将其稀释为200 ng/ml后,再做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释),分别配制成200 ng/ml,100 ng/ml,50 ng/ml,25 ng/ml,12.5 ng/ml,6.25 ng/ml,3.12 ng/ml,样品稀释液直接作为空白孔 0 ng/ml。如配制100 ng/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml )200 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液:1×20ml。
4、 检测稀释液A:1×10ml。
5、 检测稀释液B:1×10ml。
6、 检测溶液A:1×120  /瓶(1:100)。临用前以检测稀释液A 1:100稀释(如:10  检测溶液A / 990 检测稀释液A),充分混匀,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100 /孔),实际配制时应多配制  0.1-0.2ml。
7、 检测溶液B:1×120  /瓶(1:100)。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8、 底物溶液:1×10ml/瓶。
9、 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10、终止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。
11、覆膜:5张
12、使用说明书:1份

 

自备物品
1、 酶标仪(建议仪器使用前提前预热)
2、 微量加液器及吸头,EP管
3、 蒸馏水或去离子水,滤纸

标本的采集及保存
1、 血清:全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20 或-80 保存,但应避免反复冻融。
2、 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20 或-80 保存,但应避免反复冻融。
3、 其它生物标本:请1000 g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20 或-80 保    存,但应避免反复冻融。
 
注:以上标本均应密封保存,4 保存应小于1周,-20 不应超过1个月,-80 不应超过2个月;标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温,试剂不能直接在37 溶解;试剂或样品配制时,均需充分混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100  ,余孔分别加标准品或待测样品100 ,注意不要有气泡,加样 时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37 温育2小时。为保证实验结果有效
性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2、 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 (临用前配制),酶标板加上覆膜,37 温育1小时。
3、 弃去孔内液体,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分钟,大约400 /每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4、 每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100 ,加上覆膜,37 温育1小时。
5、 弃去孔内液体,甩干,洗板5次,方法同步骤3。
6、 每孔加底物溶液90 ,酶标板加上覆膜37 避光显色(反应时间控制在15-30分钟,当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显时,即可终止)。
7、 每孔加终止溶液50 ,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物    液的加入顺序相同。
8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度( 值)。

注:
1、 试剂准备:所有试剂在使用前应平衡至室温,使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污染。
2、 加样:加样或加试剂时,*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预温育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、 温育:为防止样品蒸发,实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内,以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、 洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响zui后的酶标仪读数。
5、 试剂配制:Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理,以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。请 配制标准品及工作液,尽量不要微量配制(如吸取检测溶液A时,一次不要小于10 ),以避免由于不准确稀  释而造成浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。
6、 反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,每隔10分钟),如颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7、 底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法:将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体,在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;根据需要,重复此过程数次。
2、 自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性
    本试剂盒可同时检测重组或天然的人Col Ⅲ,且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算
  各标准品及样本  值扣除空白孔  值后作图(七点图),如设置复孔,则 应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标), 值为横坐标(对数坐标),在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如 curve expert 1.3,根据样品 值,由标准曲线查出相应的浓度,乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与  值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的  值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

检测范围:3.12 ng/ml - 200 ng/ml,绘制标准曲线请取用以下浓度值:200 ng/ml,100 ng/ml,50 ng/ml,25 ng/ml,12.5 ng/ml,6.25 ng/ml,3.12 ng/ml。

zui低检测限:0.78 ng/ml

说明
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且,洗涤不充分将影响试验结果。
3. 试剂盒保存:部分试剂保存于-20℃,部分试剂保存于2-8℃,具体以标签上的标示为准。
4. 浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
6. 中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
7. 所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。
8. 有效期:6个月

 
 
 
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