本试剂盒只能用于科学研究,不得用于医学诊断 检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被植物游离脯氨酸(Free proline)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物游离脯氨酸(Free proline)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。 样品收集、处理及保存方法 1. 样本不能含叠氮钠(NaN3),因为叠氮钠(NaN3)是辣根过氧化物酶(HRP)的抑制剂。 2. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行。 3. 植物萃取液或其它相关样本:请1000 x g离心20分钟,取上清即可检测。 4. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 自备物品 1. 酶标仪(450nm) 2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒温箱 操作注意事项 1. 试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶*溶解后再使用。 2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。 3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,zui终结果乘以5才是样本实际浓度。 4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5. 所有液体组分使用前充分摇匀。 试剂盒组成 名称 | 96孔配置 | 48孔配置 | 备注 | 微孔酶标板 | 12孔×8条 | 12孔×4条 | 无 | 标准品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 无 | 样本稀释液 | 6mL | 3mL | 无 | 检测抗体-HRP | 10mL | 5mL | 无 | 20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 | 底物A | 6mL | 3mL | 无 | 底物B | 6mL | 3mL | 无 | 终止液 | 6mL | 3mL | 无 | 封板膜 | 2张 | 2张 | 无 | 说明书 | 1份 | 1份 | 无 | 自封袋 | 1个 | 1个 | 无 |
注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、1、2、4、8、16 ng/mL 试剂的准备 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。 洗板方法 1. 手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。 2. 自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。 操作步骤 1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL; 3. 样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。 6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。 结果判断 绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能 1. 准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。 2. 灵敏度:zui低检测浓度小于0.1 ng /mL。 3. 特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 4. 重复性:板内、板间变异系数均小于15%。 5. 贮藏:2-8℃,避光防潮保存。 6. 有效期:6个月 免责声明 1. 试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。 2. 严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。 |