兔抑癌基因p16 免疫组化试剂盒说明书

保存方法：2-8℃保存。     有效期：一年。     生产日期：见封口。

工作原理：

辣根过氧化物酶（HRP）的分子量（40000），它不会遮盖抗原的结合部位，具有较高活性及特异性，可溶性佳，生成的产物不扩散，可作用于多种底物，产生不同颜色且HRP穿透力强，易进入细胞内。DAB在 H2O2存在的情况下，可以作为HRP的电子供体，产生褐色的不溶颗粒，可作为显色的试剂。

试剂盒内容：

自备试剂：无水乙醇、苏木素。

操作步骤：

1. 60℃常规脱蜡至水后，将石蜡切片先后浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各10min。然后逐级降浓度酒精入水，每次3-5 min。

1. 热修复抗原： 将切片置于0.01mol/L pH6.0枸橼钠缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复1-2 次，置于室温自然冷却。0.01 mol/L  pH7.0左右的PBS洗涤3次，每次5 min
2. 消除内源性过氧化物酶：用3% H ₂ O ₂ 室温孵育 5-10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗涤2-3次，每次5 min；

4.滴加一抗： 滴加适当稀释的一抗到切片上，37℃孵育一定时间或者4℃到第二天清晨， pH7.4的PBS洗涤3次，每次5 min 。（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）

1. 加入广谱二抗，37℃孵育一段时间，取出后PBS洗涤3次，每次5 min。
2. DAB显色： 取DAB显色液I及II各50微升加至入1mL的水中，配成DAB工作液，滴加到切片上，室温显色，镜下控制反应时间。若无背景出现则可继续显色。蒸馏水充分洗涤以终止反应。
3. .观察显色后自来水冲，苏木精复染1-2min，，自来水冲10min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，干燥，分析拍照